Gαi 노크 생성

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 112(2023) 이 기사 인용

3075 액세스

13 알트메트릭

측정항목 세부정보

G-단백질 결합 수용체(GPCR)는 세포외 분자를 감지하고 세포 반응을 활성화하는 중추적인 세포막 단백질입니다. G-단백질 α 서브유닛 i(Gαi) 계열은 가장 일반적인 GPCR 결합 파트너를 나타내며 뚜렷한 신호 특성을 가진 8개의 서브유닛으로 구성됩니다. 그러나 사실상 모든 세포주에서 Gαi 하위 단위의 내인성 발현으로 인해 결합 패턴을 분석하는 것이 어려웠습니다. 여기서는 모든 Gαi 하위 단위가 결여된 HEK293 세포주를 생성하여 특정 Gαi 하위 단위의 일시적 재발현 시 GPCR-Gαi 커플링을 측정할 수 있습니다. 우리는 cAMP 축적에 대한 리간드 유도 억제 활성을 측정하여 11개 GPCR에 걸쳐 Gαi 결합 선택성을 프로파일링합니다. 그런 다음 결합 프로파일은 Gαz에 우선적으로 결합된 클러스터, Gαo에 결합된 클러스터 및 선택성이 분명하지 않은 클러스터를 나타내는 세 가지 클러스터로 분류됩니다. 이러한 결과는 개별 Gαi 결합 GPCR이 Gαi 서브유닛 수준에서 결합 선호도를 발휘하여 Gαi 신호를 미세 조정한다는 것을 나타냅니다.

세포외 자극을 하류 세포내 신호에 연결하는 주요 변환기인 G단백질 결합 수용체(GPCR)는 약물 개발의 가장 일반적인 표적입니다1. GPCR 리간드 결합 시 α, β 및 γ 하위 단위로 구성된 이종 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질(G 단백질)은 이펙터 단백질의 활성화를 유도합니다. 세 가지 하위 단위 중에서 α 하위 단위는 주로 개별 이종삼합체 G 단백질의 주요 특성을 결정합니다. 인간 게놈은 16개의 α 하위 단위를 암호화하며, 이는 서열 상동성과 기능적 유사성을 기준으로 4개의 하위 패밀리, 즉 Gαs, Gαi, Gαq 및 Gα122로 그룹화됩니다. Gαi 하위 계열은 A 계열 GPCR3,4에서 가장 일반적인 커플 링 파트너입니다. 또한, 미국 식품의약청(FDA)이 승인한 약물의 표적이 되는 GPCR의 약 45%가 Gαi 서브패밀리5와 결합하여 약물 표적으로서 Gαi 결합 GPCR의 중요성을 강조합니다.

이전 연구에서는 Gαi 하위 단위가 중복되는 기능과 별개의 기능을 모두 가지고 있음을 보여주었습니다. Gαi 서브패밀리는 Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαt1, Gαt2, Gαt3, Gαo 및 Gαz의 8개 α 하위 단위로 구성됩니다. Gi 이종삼량체의 활성화는 아데닐릴 시클라제 및 칼슘 채널의 억제, 칼륨 채널의 활성화와 같은 다양한 세포 신호 전달 과정을 유도합니다6. Gαi 서브패밀리 내의 높은 서열 상동성에도 불구하고, 여러 서브유닛 특이적 기능이 보고되었습니다. 예를 들어, 트랜스듀신(Gαt1 및 Gαt2)과 거스트듀신(Gαt3)은 cGMP 포스포디에스터라제를 활성화하여 각각 시각 및 미각 인식에 관여합니다7,8. 또한, GH4C1 세포에서 Gαi 하위 단위 녹다운 실험을 사용하여 Gαo와 Gαi2는 각각 칼슘 진입과 cAMP 축적의 억제를 중재하는 것으로 나타났습니다9. Gαi 하위 단위는 또한 생화학적으로 서로 다르게 행동합니다. 그러나 이러한 생화학적 특성은 지질막 조건보다 정제된 조건에서 더 느린 뉴클레오티드 해리를 나타내는 Gq에서 관찰된 것처럼 살아있는 세포에서 변형될 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 예를 들어, Gαo로부터 자발적인 GDP 해리 속도는 Gαi1-310보다 훨씬 빠르며, Gαz의 본질적인 GTPase 활성은 다른 Gαi 하위 단위11보다 200배 느립니다. Gαi 계열 구성원 간의 이러한 차이는 다양한 Gαi 결합 GPCR 신호 전달을 허용합니다.

Gαi 서브유닛의 신호전달 특성은 잘 특성화되어 있지만 GPCR의 Gαi 서브유닛 결합 선택성은 실험적 어려움으로 인해 제한된 수의 수용체에 대해서만 조사되었습니다. 개별 GPCR-Gαi 결합은 사실상 모든 포유류 세포가 내생적으로 여러 Gαi 하위 단위를 발현하기 때문에 관심 있는 Gαi 하위 단위를 표현하는 것만으로는 평가할 수 없습니다. 내인성 GPCR-Gαi 결합을 제거하기 위해 이전 연구에서는 Gαi 하위 단위의 C 말단 꼬리에 있는 시스테인 잔기를 ADP-리보실화하는 백일해 독소(PTX)를 사용했습니다. 시스테인 잔기에서 치환된 PTX 내성 Gαi 돌연변이를 발현함으로써 PTX 처리를 통해 돌연변이 Gαi 소단위14,15,16의 선택적 결합을 측정할 수 있습니다. 그러나 시스테인 잔기를 변경하면 α 하위 단위의 G 단백질 결합 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 PTX는 PTX 표적화 부위에 이소류신을 갖고 있기 때문에 Gαz를 억제하지 않습니다. 최근에는 개별 조작된 Gα 하위 단위의 결합을 평가하기 위해 형광 또는 생물발광 공명 에너지 전달 기반 기술이 사용되었습니다. 그러나 이러한 방법은 α 소단위체에 루시퍼라제 또는 형광 단백질을 삽입해야 하며, 이러한 변형은 생화학적 특성과 결과적인 결합 효율에 영향을 미칩니다.